过度的脂质过氧化通过产生有毒的磷脂氢过氧化物（PLOOH），在促进铁死亡中起着重要作用。因此，脂质过氧化相关的生物标志物是铁死亡的关键检测指标。

1.1 脂质过氧化物检测

BODIPY 581/591 C11 是一种脂溶性比率型荧光探针，能够嵌入细胞膜并与细胞内的脂质相互作用。在未氧化状态下，呈现红色荧光 (还原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

当细胞发生铁死亡时，亚铁离子 (Fe2+) 和 ROS 促进脂质氧化，形成脂质过氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，发射波长从 591 nm 转移到 510 nm，产生绿色荧光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 对脂溶性膜内各种活性氧 (ROS) 和过氧亚硝酸盐 (ONOO-) 也较为敏感，因此它也可以用于铁死亡细胞中 ROS 和 RNS 的检测。

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BODIPY 581/591 C11 染色参考

1. 储备液及工作液的制备:

 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 储备液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反复冻融）。

 (2) 染色前用无血清细胞培养基或 PBS 稀释储备液，制备 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液

 （请根据实际情况调整工作液浓度）。

2. 细胞染色：

 (1) 细胞制备

 悬浮细胞：4°C, 1000 ×g 离心 3-5 分钟，弃上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

 贴壁细胞：弃去培养基，加入胰蛋白酶解离细胞，制成单细胞悬液。4°C, 1000 ×g 离心 3-5 分钟，弃上清。

 PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室温孵育 30 分钟。

 (3) 4°C, 400 ×g 离心 3-4 分钟，弃上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

 (4) 用 1 mL 无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞，荧光显微镜或流式细胞仪检测。

1.2 活性氧的检测[20]

活性氧（ROS） 在铁死亡过程中不仅促进脂质过氧化和细胞损伤，还抑制抗氧化信号通路，是铁死亡检测的重要生物标志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一种可渗透细胞的活性氧探针。进入细胞后，H2DCFDA 在细胞内脱酯化，并被 ROS 氧化成具有强烈荧光的 DCF，产生绿色荧光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通过荧光显微镜、流式细胞仪或分光光度计等设备可以检测细胞内 ROS 水平。

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H2DCFDA 染色方法参考

1. 储备液及工作液的制备 :

 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA储备液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反复冻融）。

 (2) 染色前用无血清细胞培养基或PBS稀释储备液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。

 （请根据实际情况调整工作液浓度）。

2. 细胞染色：

 (1) 悬浮细胞

 · 离心收集细胞，保持密度约为1×106

 个。PBS洗涤两次，每次5分钟。

 · 加入1mL 染料工作液，室温孵育5-30分钟。

 · 400×g离心3-4分钟，弃上清。PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。

 · 用1mL无血清培养基或PBS重悬细胞，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。

 (2) 贴壁细胞

 · 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。

 · 从培养基中移出盖玻片，置于载玻片上，吸除多余培养基。加入 100 μL 染料工作液，

 轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育 5-30 分钟。

 · 吸去染料工作液，培养基洗 2-3 次，每次 5 分钟，使用荧光显微镜观察。

注：若需要用流式细胞仪检测，需将细胞用胰蛋白酶消化并重悬后再进行染色。

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1.3 过氧化脂质衍生物的检测[21][22]

脂质过氧化反应过程中，大量的脂质过氧化初级产物在氧化反应中逐渐分解为一系列复杂的醛类化合物，包括 MDA，4-HNE，丙-醛和己醛等。这些活性醛类物质能够攻击蛋白质等生物大分子，形成加合物，从而引发细胞的进一步损伤。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一种基于硫代巴比-妥酸 (TBA) 反应物法的试剂盒，脂质过氧化产物 MDA 与 TBA 在高温和酸性条件下反应，形成一种具有特定颜色的 MDA-TBA 复合物，其最大吸收波长通常在 532 nm 处，可通过比色法来定量检测脂质过氧化水平。

此外，4-HNE 抗体可以用来定量检测 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除铁死亡外的多种氧化应激状态下均可产生，在实际应用中，一般与其他检测方法进行相互验证，以提高结果的可靠性和准确性[10]。

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